Ανθρώπινη γάτα εξαρτήσεων της Elisa Pth κανένα E1055hu 1.51pg/μιλ. που προσαρμόζεται για την έρευνα

96 φρεάτια 48 ανθρώπινη υψηλή εξάρτηση ιδιομορφίας φρεατίων και ευαισθησίας PTH ELISA που προσαρμόζεται

Ακρίβεια

Η ακρίβεια δια--δοκιμής (ακρίβεια μέσα σε μια δοκιμή) τρία δείγματα της γνωστής συγκέντρωσης εξετάστηκε σε ένα πιάτο για να αξιολογήσει την ακρίβεια δια--δοκιμής.

Η ακρίβεια διά-δοκιμής (ακρίβεια μεταξύ των δοκιμών) τρία δείγματα της γνωστής συγκέντρωσης εξετάστηκε στις χωριστές δοκιμές για να αξιολογήσει την ακρίβεια διά-δοκιμής.

Βιογραφικό σημείωμα (%) = SD/mean Χ 100

Δια--δοκιμή: Βιογραφικό σημείωμα<8>

Διά-δοκιμή: Βιογραφικό σημείωμα<10>

Αρχή δοκιμής

Αυτή η εξάρτηση είναι μια ένζυμο-συνδεμένη Immunosorbent δοκιμή (ELISA). Το πιάτο έχει καλυφθεί προηγουμένως με το ανθρώπινο αντίσωμα PTH. PTH παρουσιάζει στο δείγμα προστίθεται και δεσμεύει στα αντισώματα που ντύνονται στα φρεάτια. Και έπειτα το ανθρώπινο αντίσωμα PTH προστίθεται και δεσμεύει σε PTH στο δείγμα. Κατόπιν streptavidin-HRP προστίθεται και δεσμεύει στο αντίσωμα Biotinylated PTH. Μετά από την επώαση αποδεσμευμένο streptavidin-HRP πλένεται μακριά κατά τη διάρκεια ενός βήματος πλύσης. Η λύση υποστρωμάτων προστίθεται έπειτα και το χρώμα αναπτύσσεται αναλογικά προς το ποσό του ανθρώπινου PTH. Η αντίδραση ολοκληρώνεται από την προσθήκη της όξινης λύσης στάσεων και η απορροφητικότητα μετριέται σε 450 NM.

Αντιδραστήριο παρεχόμενο

Συλλογή δειγμάτων

Ο ορός επιτρέπει στον ορό για να σβολιάσει για 10-20 λεπτά στη θερμοκρασία δωματίου. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για 20 λεπτά.

Το πλάσμα συλλέγει το πλάσμα χρησιμοποιώντας EDTA ή την ηπαρίνη ως αντιπηκτικό. Υποβάλτε τα δείγματα σε φυγοκέντρωση για 15 λεπτά σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό σε 2 - 8°C μέσα σε 30 λεπτά από τη συλλογή.

Τα ούρα συλλέγουν από τον αποστειρωμένο σωλήνα. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για περίπου 20 λεπτά. Κατά τη συλλογή του pleuroperitoneal ρευστού και εγκεφαλονωτιαίυ ρευστού, παρακαλώ ακολουθήστε τις διαδικασίες προαναφερθείσες.

Το υπερκείμενο νερό κυτταροκαλλιέργειας συλλέγει από τους αποστειρωμένους σωλήνες κατά το εξέταση εκκρίνει τα συστατικά. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για περίπου 20 λεπτά. Συλλέξτε τα supernatants προσεκτικά. Κατά την εξέταση των συστατικών μέσα στο κύτταρο, χρησιμοποιήστε PBS (pH 7.2-7.4) για να αραιώσετε την αναστολή κυττάρων στη συγκέντρωση κυττάρων περίπου 1 million/ml. Βλάψτε τα κύτταρα μέσω των επαναλαμβανόμενων freeze-thaw κύκλων για να αφήσετε έξω τα εσωτερικά συστατικά. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για περίπου 20 λεπτά.

Ιστοί ξεβγαλμάτων ιστού σε PBS (pH 7,4) για να αφαιρέσει το υπερβολικό αίμα λεπτομερώς και να ζυγίσει πριν από την ομογενοποίηση. Κομματιάστε τους ιστούς και τους ομογενοποιήστε σε PBS (pH7.4) με homogenizer γυαλιού στον πάγο. Thaw σε 2-8°C ή το πάγωμα σε -20°C. υποβάλλει σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για περίπου 20 λεπτά.

Σημείωση

• Οι συγκεντρώσεις δειγμάτων πρέπει να προβλεφθούν πρίν χρησιμοποιούνται στη δοκιμή. Εάν η συγκέντρωση δειγμάτων δεν είναι μέσα στη σειρά της τυποποιημένης καμπύλης, οι χρήστες πρέπει να μας έρθουν σε επαφή με για να καθορίσουν το βέλτιστο δείγμα για τα ιδιαίτερα πειράματά τους.
• Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται μέσα σε 5 ημέρες πρέπει να αποθηκευτούν στα δείγματα 2-8°C. πρέπει να είναι ή πρέπει να αποθηκευτούν σε -20°C μέσα σε 1 μήνα ή -80°C μέσα σε 6 μήνες. Αποφύγετε τους επαναλαμβανόμενους thaw παγώματος κύκλους.
• Τα δείγματα πρέπει να παρουσιαστούν στη θερμοκρασία δωματίου πρίν αρχίζουν τη δοκιμή.
• Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση για να συλλέξετε το δείγμα πριν τη χρήση.
• Τα δείγματα που περιέχουν NaN3 δεν μπορούν να εξεταστούν δεδομένου ότι εμποδίζει τη δραστηριότητα Peroxidase το (HRP) ραδικιών αλόγων.
• Συλλέξτε τα supernatants προσεκτικά. Όταν τα ιζήματα εμφανίστηκαν κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, η φυγοκεντρικότητα πρέπει να εκτελεσθεί πάλι.
• Η αιμόλυση μπορεί πολύ να προσκρούσει στην ισχύ των αποτελεσμάτων της δοκιμής. Πάρτε την προσοχή για να ελαχιστοποιήσετε την αιμόλυση.

*Sample δεν μπορεί να αραιωθεί με αυτήν την εξάρτηση. Εξ αιτίας του υλικού που χρησιμοποιούμε για να προετοιμάσουμε την εξάρτηση, η παρέμβαση μητρών δειγμάτων μπορεί ψευδώς να πιέσει την ιδιομορφία και την ακρίβεια της δοκιμής.

Προετοιμασία αντιδραστηρίων

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να παρουσιαστούν στη θερμοκρασία δωματίου πριν τη χρήση.

Τα πρότυπα ανασυγκροτούν το 120μl των προτύπων (1200pg/ml) με 120μl τυποποιημένο diluent για να παραγάγουν μια τυποποιημένη λύση αποθεμάτων 600pg/ml. Επιτρέψτε στα πρότυπα για να καθίσετε για 15 mins με την ευγενή αναταραχή πριν από την παραγωγή των διαλύσεων. Προετοιμάστε τα διπλά τυποποιημένα σημεία με σειριακά να αραιώσει την τυποποιημένη λύση αποθεμάτων (600pg/ml) 1:2 με τυποποιημένο diluent για τις λύσεις να παραγάγει 300pg/ml, 150pg/ml, 75pg/ml και 37.5pg/ml. Τυποποιημένο diluent χρησιμεύει ως τα μηά πρότυπα (0 pg/ml). Οποιαδήποτε υπόλοιπη λύση πρέπει να παγώσει σε -20°C και να χρησιμοποιηθεί μέσα σε έναν μήνα. Η διάλυση των τυποποιημένων λύσεων προτεινόμενων είναι η ακόλουθη:

Απομονωτής αραιό 20ml πλυσίματος της συμπύκνωσης 30x απομονωτών πλυσίματος εξιοντισμένος ή αποσταγμένο νερό για να παραγάγει 500 μιλ. του απομονωτή πλυσίματος 1x. Εάν τα κρύσταλλα έχουν διαμορφώσει στη συμπύκνωση, το μίγμα ήπια μέχρι τα κρύσταλλα έχει διαλύσει εντελώς.

Περίληψη

1. Προετοιμάστε όλα τα αντιδραστήρια, τα δείγματα και τα πρότυπα.

2. Προσθέστε το δείγμα και το αντιδραστήριο της ELISA σε κάθε ένα καλά. Επωάστε για 1 ώρα σε 37°C.

3. Πλύντε το πιάτο 5 φορές.

4. Προσθέστε τη λύση Α και Β. Incubate υποστρωμάτων για 10 λεπτά σε 37°C.

5. Προσθέστε τη λύση στάσεων και το χρώμα αναπτύσσεται.

6. Διαβάστε την αξία OD μέσα σε 10 λεπτά.

Υπολογισμός του αποτελέσματος

Κατασκευάστε μια τυποποιημένη καμπύλη με τη χάραξη του μέσου OD για κάθε πρότυπα στον κάθετο (ω) άξονα ενάντια στη συγκέντρωση στον οριζόντιο (X) άξονα και επισύρετε την προσοχή μια καλής εφαρμογής καμπύλη μέσω των σημείων στη γραφική παράσταση. Αυτοί οι υπολογισμοί μπορούν να εκτελεσθούν καλύτερα με το βασισμένο σε υπολογιστή καμπύλη-κατάλληλο λογισμικό και η καλής εφαρμογής γραμμή μπορεί να καθοριστεί από την ανάλυση οπισθοδρόμησης.