Προσάρμοσε αυτήν την εξάρτηση σάντουιτς είναι Fibrillary όξινη πρωτεϊνική ELISA αρουραίων εργαστηριακής έρευνας υψηλής ακρίβειας εξάρτηση δοκιμής Glial

Προσάρμοσε αυτήν την εξάρτηση σάντουιτς είναι Fibrillary όξινη πρωτεϊνική ELISA αρουραίων εργαστηριακής έρευνας υψηλής ακρίβειας εξάρτηση δοκιμής Glial

Τυποποιημένη σειρά καμπυλών: 10pg/ml - 2000pg/ml

Ευαισθησία: 5.43pg/ml

Μέγεθος: 96 φρεάτια

Αποθήκευση: Αποθηκεύστε τα αντιδραστήρια σε 2-8°C. _για έξι μηνών αποθήκευση αναφέρομαι ο λήξη ημερομηνία κρατώ αυτός -20°C. απο:φεύγω επανα:λαμβάνω thaw κύκλος. Εάν τα μεμονωμένα αντιδραστήρια ανοίγουν συνιστάται η εξάρτηση να χρησιμοποιείται μέσα σε 1 μήνα.

*This το προϊόν είναι για την ερευνητική χρήση μόνο, όχι για τη χρήση στις διαδικασίες διαγνώσεων. _αυτός είμαι ιδιαίτερα συστήνω να διαβάζω αυτός οδηγία εξ ολοκλήρου πριν τη χρήση.

Προετοιμασία αντιδραστηρίων

Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να παρουσιαστούν στη θερμοκρασία δωματίου πριν τη χρήση.

Τα πρότυπα ανασυγκροτούν το 120μl των προτύπων (2400pg/ml) με 120μl τυποποιημένο diluent για να παραγάγουν μια τυποποιημένη λύση αποθεμάτων 1200pg/ml. Επιτρέψτε στα πρότυπα για να καθίσετε για 15 mins με την ευγενή αναταραχή πριν από την παραγωγή των διαλύσεων. Προετοιμάστε τα διπλά τυποποιημένα σημεία με σειριακά να αραιώσει την τυποποιημένη λύση αποθεμάτων (1200pg/ml) 1:2 με τυποποιημένο diluent για τις λύσεις να παραγάγει 600pg/ml, 300pg/ml, 150pg/ml και 75pg/ml. Τυποποιημένο diluent χρησιμεύει ως τα μηά πρότυπα (0 pg/ml). Οποιαδήποτε υπόλοιπη λύση πρέπει να παγώσει σε -20°C και να χρησιμοποιηθεί μέσα σε έναν μήνα. Η διάλυση των τυποποιημένων λύσεων προτεινόμενων είναι η ακόλουθη:

Απομονωτής αραιό 20ml πλυσίματος της συμπύκνωσης 25x απομονωτών πλυσίματος εξιοντισμένος ή αποσταγμένο νερό για να παραγάγει 500 μιλ. του απομονωτή πλυσίματος 1x. Εάν τα κρύσταλλα έχουν διαμορφώσει στη συμπύκνωση, το μίγμα ήπια μέχρι τα κρύσταλλα έχει διαλύσει εντελώς.

Αρχή δοκιμής

Αυτή η εξάρτηση δοκιμής elisa είναι μια ένζυμο-συνδεμένη Immunosorbent δοκιμή (ELISA). Το πιάτο έχει καλυφθεί προηγουμένως με το αντίσωμα αρουραίων GFAP. GFAP παρουσιάζει στο δείγμα προστίθεται και δεσμεύει στα αντισώματα που ντύνονται στα φρεάτια. Και έπειτα το αντίσωμα αρουραίων GFAP προστίθεται και δεσμεύει σε GFAP στο δείγμα. Κατόπιν streptavidin-HRP προστίθεται και δεσμεύει στο αντίσωμα Biotinylated GFAP. Μετά από την επώαση αποδεσμευμένο streptavidin-HRP πλένεται μακριά κατά τη διάρκεια ενός βήματος πλύσης. Η λύση υποστρωμάτων προστίθεται έπειτα και το χρώμα αναπτύσσεται αναλογικά προς το ποσό αρουραίου GFAP. Η αντίδραση ολοκληρώνεται από την προσθήκη της όξινης λύσης στάσεων και η απορροφητικότητα μετριέται σε 450 NM.

Συλλογή δειγμάτων

Ο ορός επιτρέπει στον ορό για να σβολιάσει για 10-20 λεπτά στη θερμοκρασία δωματίου. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για 20 λεπτά.

Το πλάσμα συλλέγει το πλάσμα χρησιμοποιώντας EDTA ή την ηπαρίνη ως αντιπηκτικό. Υποβάλτε τα δείγματα σε φυγοκέντρωση για 15 λεπτά σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό σε 2 - 8°C μέσα σε 30 λεπτά από τη συλλογή.

Τα ούρα συλλέγουν από τον αποστειρωμένο σωλήνα. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για περίπου 20 λεπτά. Κατά τη συλλογή του pleuroperitoneal ρευστού και εγκεφαλονωτιαίυ ρευστού, παρακαλώ ακολουθήστε τις διαδικασίες προαναφερθείσες.

Το υπερκείμενο νερό κυτταροκαλλιέργειας συλλέγει από τους αποστειρωμένους σωλήνες κατά το εξέταση εκκρίνει τα συστατικά. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για περίπου 20 λεπτά. Συλλέξτε τα supernatants προσεκτικά. Κατά την εξέταση των συστατικών μέσα στο κύτταρο, χρησιμοποιήστε PBS (pH 7.2-7.4) για να αραιώσετε την αναστολή κυττάρων στη συγκέντρωση κυττάρων περίπου 1 million/ml. Βλάψτε τα κύτταρα μέσω των επαναλαμβανόμενων freeze-thaw κύκλων για να αφήσετε έξω τα εσωτερικά συστατικά. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για περίπου 20 λεπτά.

Ιστοί ξεβγαλμάτων ιστού σε PBS (pH 7,4) για να αφαιρέσει το υπερβολικό αίμα λεπτομερώς και να ζυγίσει πριν από την ομογενοποίηση. Κομματιάστε τους ιστούς και τους ομογενοποιήστε σε PBS (pH7.4) με homogenizer γυαλιού στον πάγο. Thaw σε 2-8°C ή το πάγωμα σε -20°C. υποβάλλει σε φυγοκέντρωση σε 2000-3000 περιστροφή/λεπτό για περίπου 20 λεπτά.

Σημείωση

• Οι συγκεντρώσεις δειγμάτων πρέπει να προβλεφθούν πρίν χρησιμοποιούνται στη δοκιμή. Εάν η συγκέντρωση δειγμάτων δεν είναι μέσα στη σειρά της τυποποιημένης καμπύλης, οι χρήστες πρέπει να μας έρθουν σε επαφή με για να καθορίσουν το βέλτιστο δείγμα για τα ιδιαίτερα πειράματά τους.
• Τα δείγματα που χρησιμοποιούνται μέσα σε 5 ημέρες πρέπει να αποθηκευτούν στα δείγματα 2-8°C. πρέπει να είναι ή πρέπει να αποθηκευτούν σε -20°C μέσα σε 1 μήνα ή -80°C μέσα σε 6 μήνες. Αποφύγετε τους επαναλαμβανόμενους thaw παγώματος κύκλους.
• Τα δείγματα πρέπει να παρουσιαστούν στη θερμοκρασία δωματίου πρίν αρχίζουν τη δοκιμή.
• Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση για να συλλέξετε το δείγμα πριν τη χρήση.
• Τα δείγματα που περιέχουν NaN3 δεν μπορούν να εξεταστούν δεδομένου ότι εμποδίζει τη δραστηριότητα Peroxidase το (HRP) ραδικιών αλόγων.
• Συλλέξτε τα supernatants προσεκτικά. Όταν τα ιζήματα εμφανίστηκαν κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, η φυγοκεντρικότητα πρέπει να εκτελεσθεί πάλι.
• Η αιμόλυση μπορεί πολύ να προσκρούσει στην ισχύ των αποτελεσμάτων της δοκιμής. Πάρτε την προσοχή για να ελαχιστοποιήσετε την αιμόλυση.

*Sample δεν μπορεί να αραιωθεί με αυτήν την εξάρτηση. Εξ αιτίας του υλικού που χρησιμοποιούμε για να προετοιμάσουμε την εξάρτηση, η παρέμβαση μητρών δειγμάτων μπορεί ψευδώς να πιέσει την ιδιομορφία και την ακρίβεια της δοκιμής.

Διαδικασία δοκιμής

1. Προετοιμάστε όλα τα αντιδραστήρια, τις τυποποιημένες λύσεις και τα δείγματα όπως καθοδηγείται. Φέρτε όλα τα αντιδραστήρια στη θερμοκρασία δωματίου πριν τη χρήση. Η δοκιμή εκτελείται στη θερμοκρασία δωματίου.

2. Καθορίστε τον αριθμό λουρίδων που απαιτούνται για τη δοκιμή. Παρεμβάλτε τις λουρίδες στα πλαίσια για τη χρήση. Οι αχρησιμοποίητες λουρίδες πρέπει να αποθηκευτούν σε 2-8°C.

3. Προσθέστε τα πρότυπα 50μl στα πρότυπα καλά. Σημείωση: Μην προσθέστε το αντίσωμα στα πρότυπα καλά επειδή η τυποποιημένη λύση περιέχει το αντίσωμα.

4. Προσθέστε δείγμα στο δείγμα τα φρεάτια 40μl και προσθέτει έπειτα το αντίσωμα αντι-GFAP 10μl στα φρεάτια δειγμάτων, κατόπιν προσθέστε 50μl streptavidin-HRP στα φρεάτια δειγμάτων και τα τυποποιημένα φρεάτια (μη κενός έλεγχος καλά). Μίγμα καλά. Καλύψτε το πιάτο με sealer. Επωάστε 60 λεπτά σε 37°C.

5. Αφαιρέστε sealer και πλύντε το πιάτο 5 φορές με τον απομονωτή πλυσίματος. Ενυδατώστε τα φρεάτια με τουλάχιστον τον απομονωτή πλυσίματος 0,35 μιλ. για 30 δευτερόλεπτα σε 1 λεπτό για κάθε πλύσιμο. Για την αυτοματοποιημένη πλύση, απορροφήστε όλα τα φρεάτια και πλύντε 5 φορές με τον απομονωτή πλυσίματος, που υπερχειλίζει τα φρεάτια με τον απομονωτή πλυσίματος. Λεκιάστε το πιάτο επάνω στις πετσέτες εγγράφου ή άλλο απορροφητικό υλικό.

6. Προσθέστε τη λύση Α υποστρωμάτων 50μl σε κάθε ένα καλά και προσθέστε έπειτα τη λύση Β υποστρωμάτων 50μl σε κάθε ένα καλά. Επωάστε το πιάτο που καλύπτεται με νέο sealer για 10 λεπτά σε 37°C στο σκοτάδι.

7. Προσθέστε τη λύση στάσεων 50μl σε κάθε μια καλά, το μπλε χρώμα θα αλλάξει σε κίτρινο αμέσως.

8. Καθορίστε την οπτική πυκνότητα (αξία OD) κάθε μια καλά αμέσως χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη microplate που τίθεται 450 NM μέσα σε 10 μενουέτα μετά από να προσθέσει τη λύση στάσεων.

Referances

«Η απώλεια glial fibrillary όξινου πρωτεϊνικού (GFAP) εξασθενίζει τον πολλαπλασιασμό κυττάρων Schwann και καθυστερεί την αναγέννηση νεύρων μετά από τη ζημία.»

Triolo Δ., Dina Γ., Lorenzetti Ι., Malaguti Μ., Morana Σελ., Del Carro U., Comi Γ., που βρωμίζει το Α., Quattrini Α., Previtali S.C.

J. κύτταρο. Sci. 119:3981 3993(2006)